Nanovarillas de oro modificadas con un aptámero anti-α-trombina humana para el diseño de un ensayo de afinidad plasmónico

DELPINO, ROCÍO A.; CARLA S. NOBILE; REARTES, DAIANA; MARCELA C. RODRIGUEZ

CORRIENTES

Congreso; XI CONGRESO ARGENTINO DE QUÍMICA ANALÍTICA; 2021

AAQA

Los nanomateriales presentan propiedades fisicoquímicas y electrónicas sobresalientes las cuales son de gran importancia a la hora de diseñar nuevos materiales avanzados con funcionalidad específica. Existe una gran variedad de protocolos disponibles para la obtención de nanomateriales con diferentes tamaños y relaciones de aspecto. En este trabajo se presenta la síntesis, caracterización y optimización de nanovarillas de oro (AuNRs), modificadas con un aptámero anti-α-trombina, como biomolécula de reconocimiento específico, aplicadas al diseño de un ensayo para la detección de eventos de bioafinidad. Con este objetivo, se llevó a cabo la síntesis coloidal de AuNRs empleando una metodología mediada por semillas, sin molde.1-4 Las semillas de oro fueron sintetizadas en solución mediante reducción de ácido cloroáurico utilizando borohidruro de sodio como agente reductor fuerte en presencia de un agente de protección (bromuro de cetiltrimetilamonio). Las semillas constituyeron sitios de nucleación para el crecimiento anisotrópico de los AuNRs. Estas se incorporaron a una solución conteniendo ácido cloroáurico, bromuro de cetiltrimetilamonio (agente direccional de crecimiento), nitrato de plata (que influye en la ruptura de la simetría) y ácido ascórbico (agente reductor débil). Los AuNRs sintetizados fueron lavados, eliminando el exceso de surfactante con el fin de evitar su interferencia en pasos posteriores. Se caracterizó cada etapa de síntesis empleando espectroscopía UV-visible, dispersión de luz dinámica (DLS), microscopia de barrido electrónico (SEM) y transmisión electrónica (TEM), permitiendo optimizar las condiciones de trabajo para obtener AuNRs de longitud controlada y monodispersos. Para ello se evaluaron variables involucradas en la síntesis, tales como composición de la solución, concentración de surfactante y agentes reductores, tiempo, temperatura y pH. Los aptámeros presentan numerosas ventajas, entre ellas, al presentar un tamaño reducido (5 a 25 kDa) son atóxicos, exhiben alta penetración tisular, poseen muy baja inmunogenicidad, se producen sintéticamente, pueden modificarse con grupos específicos y adoptan estructuras tridimensionales estables capaces de reconocer en forma específica moléculas target, lo cual los convierte en los biorreceptores de afinidad de elección frente a otras biomoléculas. Los AuNRs obtenidos en condiciones óptimas se emplearon como plataforma para la inmovilización de un aptámero anti α-trombina humana, el cual se encuentra constituido por ADN de simple hebra con una secuencia determinada de 15 bases guanina y timina. Cuenta además con una prolongación de 6 bases timina permitiendo una óptima exposición del aptámero para reconocer específicamente α-trombina humana. Se evaluaron dos aptámeros: un aptámero anti α-trombina humana sin modificar (TBA) y otro modificado con un grupo tiol, al cual se añadió en su extremo 5´ (SH-TBA). En el caso del TBA la secuencia se inmovilizó en la superficie de los AuNRs por interacción de las bases del DNA, mientras que en el caso del SH-TBA la inmovilización se produjo por interacción de las bases y el enlace covalente establecido con el azufre del grupo tiol. Si bien ambos aptámeros estabilizan la estructura, la presencia del grupo tiol aporta mayor estabilidad5. Mediante espectroscopía UV-visible se estudiaron las interacciones entre las bases del aptámero y los AuNRs, incluyendo también la interacción adicional del grupo tiol en SH-TBA. Las condiciones de trabajo fueron optimizadas de modo tal de lograr la mayor sensibilidad en la obtención de señal plasmónica3,4